Ce projet vise à développer de nouveaux nano-outils, substituts photo-activables de NADPH appelés nanotriggers NT, pour leur conférer une meilleure affinité et spécificité pour l'enzyme NO-synthase endothéliale, eNOS. Le premier nanotrigger (NT1, Figure 1), dérivé du substrat NADPH, possédant une adénosine phosphorylée comme motif de reconnaissance enzymatique relié à un chromophore photoactivable de type diaminophényl butadiène par une liaison amide, a été synthétisé et montré son efficacité en initiant l'activité catalytique de eNOS déclenchée par impulsion laser in vitro et en cellules endothéliales (E. Beaumont et al. Chembiochem 2009, 10, 690). Nous allons préparer deux nouvelles séries de nanotriggers qui comportent une partie adénosine reliée au chromophore 1,4-diaminophényl 1,3-diène par un motif triazole. Le motif triazole peut être obtenu par une cycloaddition 1,3-dipolaire d'Huisgen entre un azoture et un alcyne catalysée par le Cu(I) (chimie « click »). L'intérêt de la chimie « click » réside dans sa simplicité de mise en oeuvre et son efficacité qui facilite la synthèse de molécules polyfonctionnelles. En fonctionnalisant l'adénosine par un groupe azido, et le chromophore par un alcyne, nous pouvons synthétiser une librairie de molécules en faisant différentes combinaisons. Des études de modélisation moléculaire réalisées par l'équipe d'Anny Schwok à l'INRA ont montré que la fonction amine de l'adénosine n'est pas indispensable à la reconnaissance, et que certains sites du nanotrigger pourraient être modifiés afin d'améliorer la spécificité. Dans la 1ère série (NT2), nous remplacerons le groupe amine de l'adénosine par un atome d'hydrogène ou de chlore, et introduirons un sulfate ou carboxylate en position 2' pour favoriser l'interaction avec les arginines de l'enzyme. Pour améliorer la spécificité pour eNOS, nous allons introduire un motif supplémentaire (une chaîne carboxylique à côté de l'adénosine et du chromophore) de reconnaissance avec des résidus variables de eNOS dans la 2ème série (NT3).
L'équipe de biophotonique dirigé par Eric Deprez sera responsable de la caractérisation in vitro des nanotriggers, comprenant notamment la caractérisation photophysique des composés (détermination des propriétés d'absorption et de fluorescence à deux photons) et l'étude des propriétés de fixation des composés à la eNOS (constante d'affinité) par fluorescence à deux photons en vue de tester la sélectivité moléculaire par rapport à d'autres enzymes à NADPH (par exemple, la nNOS, la NADPH oxydase...). Selon les résultats obtenus, des mesures cellulaires (imagerie) et tissulaires (vasorelaxation d'anneaux d'aortes) pourront être réalisées avec E Deprez et Chantal Dessy (UCL, Belgique). Récemment, E. Deprez et coll. ont pu montrer qu'une autre série de composés appelés Nanoshutter, reconnaissaient bien la NOS endothéliale dans un contexte cellulaire (cellules HUVEC pour Human Umbilical Vein Endothelial Cell) et permettaient ainsi d'imager eNOS aussi bien par microscopie de fluorescence 1-photon que 2-photon. Les propriétés in vivo de ces molécules seront testées sur la plateforme ouverte de chirurgie et de radiologie Interventionnelle du centre de recherche de Jouy en Josas.

Notre approche devrait permettre de développer des nano-outils photoactivables présentant une spécificité pour l'isoforme endothéliale par rapport aux autres isoformes des NOS, basée sur la reconnaissance moléculaire de son site NADPH, ce qui n'existe pas actuellement. Seules des molécules visant l'hème de l'isoforme neuronale ont été développées par Silvermann. Il s'agit donc d'un challenge tant au niveau fondamental (maîtrise des interactions moléculaires spécifiques au site NADPH de eNOS) qu'au niveau des applications.